La ribonucleasa PNPasa es un regulador clave de la formación de biopelículas en Listeria monocytogenes y afecta la invasión de las células huésped.

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 34 (2023) Citar este artículo

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Las biopelículas proporcionan un entorno que protege a los microorganismos del estrés externo, como la privación de nutrientes, los tratamientos con antibióticos y las defensas inmunitarias, creando así condiciones favorables para la patogenia y la supervivencia bacteriana. Aquí mostramos que la proteína de unión al ARN y la ribonucleasa polinucleótido fosforilasa (PNPasa) es un regulador positivo de la formación de biopelículas en el patógeno humano Listeria monocytogenes, uno de los principales responsables de la contaminación de los alimentos en los entornos de procesamiento de alimentos. La cepa mutante de PNPasa produce menos biomasa de biopelícula y exhibe una morfología de biopelícula alterada que es más susceptible al tratamiento con antibióticos. A través de ensayos bioquímicos y análisis microscópicos, demostramos que la PNPasa es un regulador no reconocido previamente de la composición de la matriz extracelular del biofilm, que afecta en gran medida los niveles de proteínas, ADN extracelular y azúcares. Cabe destacar que hemos adaptado el uso del complejo fluorescente rojo rutenio-fenantrolina para la detección de polisacáridos en biopelículas de Listeria. El análisis transcriptómico de biopelículas mutantes de PNPasa y de tipo salvaje revela que la PNPasa afecta muchas vías reguladoras asociadas con la formación de biopelículas, particularmente al afectar la expresión de genes involucrados en el metabolismo de carbohidratos (p. ej., lmo0096 y lmo0783, que codifican componentes de PTS), de aminoácidos (p. ej., lmo1984 y lmo2006, que codifican enzimas biosintéticas) y en el sistema similar a detección de quórum Agr (lmo0048-49). Además, mostramos que la PNPasa afecta los niveles de ARNm del regulador maestro de la virulencia PrfA y los genes regulados por PrfA, y estos resultados podrían ayudar a explicar la internalización bacteriana reducida en células humanas del mutante ΔpnpA. En general, este trabajo demuestra que la PNPasa es un importante regulador postranscripcional de la virulencia y la adaptación al estilo de vida del biofilm de las bacterias Gram-positivas y destaca el papel cada vez mayor de las ribonucleasas como actores críticos en la patogenicidad.

Las biopelículas son el modo predominante de crecimiento de los microorganismos en los ecosistemas naturales. Sin embargo, han sido una preocupación médica creciente dado que el 80% de las infecciones microbianas están asociadas con biopelículas1,2 y contribuyen a la persistencia de infecciones crónicas3. Las biopelículas se definen como comunidades de microorganismos que se adhieren a superficies bióticas o abióticas y están encerradas en sustancias poliméricas extracelulares (EPS) hidratadas de producción propia, también conocidas como matriz de biopelícula4,5. Los polisacáridos, las proteínas, los fosfolípidos y los ácidos nucleicos son los principales componentes de la matriz extracelular del biofilm6. Los microorganismos sésiles están protegidos por la matriz que los rodea y pueden soportar estreses externos como la privación de nutrientes y la desecación mucho mejor que las bacterias planctónicas, además de ser mucho menos susceptibles a la acción de los agentes antimicrobianos y las defensas inmunitarias del huésped7. La estructura del biofilm permite la acumulación de componentes de las células lisadas y favorece la transferencia horizontal de genes entre bacterias y la comunicación célula-célula6,8.

La formación de biopelículas se ha asociado con la virulencia en varias bacterias patógenas al promover la infección. Listeria monocytogenes (Listeria) es una bacteria patógena Gram-positiva que causa listeriosis, una de las infecciones alimentarias más letales en humanos9. Puede sobrevivir intracelularmente, manipular las maquinarias celulares del huésped y escapar del sistema inmunitario10. L. monocytogenes soporta condiciones ambientales adversas como bajas temperaturas, bajo pH y altas concentraciones de sal11. Además, puede adherirse a varios tipos de superficies, persistir en forma de biopelículas en entornos de procesamiento de alimentos y contaminar los productos alimenticios, lo que convierte a esta bacteria en una carga importante para la industria alimentaria12,13,14,15. Cuando se cultivan en condiciones estáticas, las biopelículas de L. monocytogenes pueden adoptar la forma de una monocapa bacteriana16 o formar una biopelícula similar a un panal17. También pueden formar estructuras en forma de bola en condiciones de flujo continuo18.

La formación de biopelículas es un proceso complejo y multifactorial. En L. monocytogenes, como en otros patógenos bacterianos, se ha demostrado que la capacidad de natación19 y el sistema Agr quorum sensing-like son importantes en las primeras etapas de la formación de biopelículas, estando implicado este último en la regulación de proteínas relevantes para la adhesión a superficies y/o bacterias20,21. Además, tanto el regulador transcripcional de la virulencia PrfA como el regulador de la respuesta al estrés σB son importantes para el desarrollo de biopelículas en Listeria, concretamente al controlar la expresión de genes como actA, inlA y rmlA22,23,24,25. Por ejemplo, se demostró que el factor ActA regulado por PrfA está implicado en la agregación bacteriana, un paso clave en la formación de biopelículas24. PrfA es responsable de la expresión de varios factores de virulencia, como las proteínas de superficie internalinas, que son esenciales para la invasión de líneas celulares de mamíferos10,26. Además, otros factores juegan un papel en la formación de biopelículas en bacterias patógenas, como sRNAs27,28 y c-di-GMP29,30.

Otro factor que regula la formación de biopelículas en otras especies bacterianas es la proteína polinucleótido fosforilasa (PNPasa) que se une al ARN. Es una exoribonucleasa 3'-5' altamente conservada que cataliza la degradación y el procesamiento del ARN31 y se ha implicado en procesos relacionados con la virulencia en diferentes especies bacterianas32,33,34. Anteriormente habíamos descubierto que la PNPasa es una enzima importante en L. monocytogenes en el procesamiento y la función de un elemento CRISPR35. En las bacterias Gram negativas Escherichia coli K-12 y Salmonella enterica serovar Typhimurium, se demostró que la inactivación de la PNPasa perjudica la formación de biopelículas36,37,38. Sin embargo, en la cepa C de E. coli, el mutante con deleción de PNPasa mostró una mayor formación de biopelículas39. Por lo tanto, el papel de la PNPasa en la formación de biopelículas aún no se ha explicado completamente, mientras que aún se desconoce si la PNPasa afecta la formación de biopelículas en bacterias Gram-positivas.

En este trabajo mostramos que la inactivación de la PNPasa en L. monocytogenes provoca una invasión celular reducida y fuertes defectos en la producción de biopelículas, lo que afecta en gran medida a la composición de la matriz extracelular. Además, el análisis de secuenciación de ARN mostró que la PNPasa participa en la regulación de distintas vías que influyen en la formación de biopelículas, a saber, la detección de quórum y el metabolismo de carbohidratos y aminoácidos. Por lo tanto, presentamos PNPase como un nuevo regulador de biopelículas en patógenos Gram-positivos.

La PNPasa se ha implicado en procesos relacionados con la virulencia en diferentes especies bacterianas, aunque su función aún no se comprende por completo y puede diferir entre diferentes bacterias (revisado en la ref. 31). Para determinar si la PNPasa es importante para la virulencia de L. monocytogenes, probamos la capacidad de las cepas de tipo salvaje (WT), el mutante con deleción de PNPasa (ΔpnpA) y las cepas complementadas con PNPasa (ΔpnpA::pnpA) para invadir las células huésped. Para eso, utilizamos dos líneas de células epiteliales humanas bien establecidas: HeLa (aislada de cáncer de cuello uterino y comúnmente utilizada como modelo de estudio) y HepG2 (células derivadas de hepatocitos, ya que el hígado es un objetivo preferido para la infección por Listeria). Se utilizaron cultivos bacterianos para infectar las células humanas durante una hora, seguido de un tratamiento de una hora con gentamicina que elimina las bacterias extracelulares40. Las bacterias intracelulares se recuperaron después de la lisis de la célula huésped y se determinó la viabilidad en placas de agar BHI. Nuestros resultados mostraron que la PNPasa era necesaria para entrar en ambas líneas celulares, ya que el mutante ΔpnpA era menos invasivo que el tipo salvaje (disminución de ~95 % en HeLa y 80 % en HepG2) (Fig. 1). La cepa complementada mostró recuperación parcial en la infección de HeLa y complementación completa en la infección de HepG2. Estos resultados demuestran que la PNPasa es importante para la infección por L. monocytogenes. Este hecho está de acuerdo con lo descrito para otras bacterias patógenas34 y destaca un papel de la PNPasa en la virulencia bacteriana.

Cuantificación de bacterias intracelulares en células HeLa y HepG2 a las 2 horas posteriores a la infección, a MOI 50 para HeLa y MOI 40 para HepG2. Los valores replicados promedio se normalizaron a la concentración del inóculo (CFU/mL en el momento de la infección) y los datos transformados se expresaron como el porcentaje de bacterias supervivientes en relación con el tipo salvaje. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes. La significancia se determinó mediante una prueba t no pareada; *P < 0,05, **P < 0,01.

Los cambios en el tamaño, la forma y la motilidad de las células se han asociado con defectos de virulencia de los patógenos bacterianos, ya que estos rasgos pueden afectar la invasión del huésped41,42. Para determinar si la diferencia en la capacidad de colonización de las células huésped por Listeria monocytogenes EGD-e (tipo salvaje) y los cultivos mutantes ΔpnpA podría resultar de una variación fenotípica entre estas cepas, primero analizamos su morfología celular microscópica (Fig. 2a ). No se encontraron diferencias significativas en el tamaño celular entre estas dos cepas o la cepa complementada. A continuación, analizamos la morfología de las macrocolonias de todas las cepas cultivadas en placas de agar BHI; y se observaron diferencias llamativas (Fig. 2b). Todas las colonias se caracterizaron por un núcleo central con un anillo concéntrico rodeado por un área periférica de morfología lisa. Sin embargo, la región externa de las macrocolonias de tipo salvaje y complementadas presentó un borde lobulado, mientras que el mutante ΔpnpA mostró una zona de crecimiento suave más regular. La diferencia más notable se encontró en la región interna, ya que el tipo salvaje mostró una apariencia granular. En cambio, el mutante ΔpnpA mostró una morfología moteada, que no se limitó al núcleo interno, sino que se observó en toda la macrocolonia y se asemejaba a estructuras huecas en la superficie (una imagen ampliada de áreas representativas de cada macrocolonia se muestra mejor). visualizar las diferentes características) (Fig. 2b). Este fenotipo no se observó en la cepa complementada, que era más similar a la apariencia granular encontrada en el tipo salvaje. Dado que los flagelos y la motilidad también se han asociado con la virulencia, decidimos evaluar si la PNPasa podría afectar la capacidad de natación de Listeria. Los cultivos del tipo salvaje y el mutante ΔpnpA se colocaron en placas de agar blando BHI (Fig. 2c). La supresión de PNPasa dio como resultado una cepa con motilidad reducida (alrededor de un 70 % menos) en comparación con el tipo salvaje. Este fenotipo defectuoso se restauró por completo en la cepa complementada con PNPasa.

a Imágenes representativas de células bacterianas individuales en la fase exponencial media (DO600 a 0,7–0,8) para evaluar el tamaño y la morfología de las células. Barras de escala, 1 µm (izquierda). Diagrama de barras de tamaños celulares promedio de dos réplicas biológicas independientes de cada cepa (derecha). Los datos representan la media ± SD. La significación se determinó mediante una prueba t no pareada. ns, no significativo; *P < 0,05. b Imágenes representativas de la observación de macrocolonias usando un microscopio zoom. Cada cepa se inoculó en placa de agar BHI y se incubó a 37 °C durante 8 días. El panel inferior corresponde a una ampliación de zoom. Barras de escala, 1000 µm. c Imágenes representativas de la evaluación de la motilidad de natación de cultivos de bacterias en agar BHI al 0,3 % (p/v) e incubadas a 25 °C durante 48 h (izquierda). Gráfico de barras de las zonas de baño de cada cepa (derecha). Los valores de réplica promediados se transformaron como el porcentaje de motilidad en relación con el tipo salvaje. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes. La significancia se determinó mediante una prueba t no pareada; **P < 0,01, ***P < 0,005.

En conjunto, estos resultados mostraron que la inactivación de la PNPasa provoca cambios fenotípicos, con diferencias encontradas en la morfología de las colonias y la motilidad celular, que se correlacionan con la naturaleza menos invasiva de esta cepa.

La morfología y la motilidad de las colonias son dos fenotipos interconectados que se sabe que afectan la formación de biopelículas bacterianas43,44. Para determinar si el morfotipo alterado y los defectos de motilidad encontrados en la PNPasa mutante de Listeria monocytogenes podrían afectar la formación de biopelículas, a continuación comparamos la cantidad de biopelículas producidas por las cepas de tipo salvaje, ΔpnpA y complementadas. Las bacterias se cultivaron estáticamente en medio BHI a 37 °C en placas de 24 pocillos. Después de la eliminación de las células planctónicas y el lavado, las biopelículas adheridas a la superficie se tiñeron con cristal violeta (CV). Observamos que el mutante de deleción de Listeria PNPase era claramente defectuoso (40% menos) en la formación de biopelículas en comparación con el tipo salvaje (Fig. 3a). Este fenotipo se recuperó al menos parcialmente en la cepa complementada con PNPasa. Además, la morfología de la biopelícula observada en el mutante ΔpnpA fue notablemente diferente de las biopelículas de las otras dos cepas (Fig. 3a, izquierda). La inactivación de la PNPasa dio como resultado una biopelícula con bordes rayados pronunciados que no se detectaron en las células que expresaban la PNPasa. Además, observamos que la biopelícula en el mutante ΔpnpA se desprendió más fácilmente durante los pasos de lavado, lo que sugiere que esta biopelícula se adhiere menos y está menos estructurada.

a Las biopelículas se cultivaron estáticamente a 37 °C durante 48 h y la biomasa de la biopelícula se determinó mediante el método de tinción con cristal violeta. A la izquierda, se tomaron imágenes de biopelículas después de la adición de cristal violeta. A la derecha, se representaron los valores promediados de la absorbancia a 595 nm. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes. La significancia se determinó mediante una prueba t no pareada; *** P < 0,005. b Se reconstruyeron estructuras tridimensionales representativas de las biopelículas después de adquirir imágenes de pila z por CLSM después del crecimiento a 37 °C durante 48 h. c COMSTAT cuantificó la biomasa, el espesor máximo y el coeficiente de rugosidad de las biopelículas fotografiadas. Los valores duplicados se promediaron y trazaron. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes. La significancia se determinó mediante una prueba t no pareada; *P < 0,05. d Imágenes representativas de biopelículas observadas por SEM con aumentos de 2000x y ×10 000.

Para evaluar aún más la arquitectura del biofilm de Listeria, utilizamos microscopía de escaneo láser confocal (CLSM). Las biopelículas se cultivaron en cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocillos durante 48 h a 37 °C. Luego, las biopelículas se lavaron suavemente para eliminar las células bacterianas sueltas y se tiñeron con SYTO™ 9, un tinte de ácido nucleico fluorescente que permea las células y marca las bacterias y el ADN extracelular45 (eADN). Se obtuvieron pilas Z de cada biopelícula y se reconstruyeron en proyecciones tridimensionales. Como se muestra en la Fig. 3b, la cepa de tipo salvaje de Listeria formó biopelículas que se asemejaban a un césped denso de bacterias con algunos agregados celulares. Por el contrario, la cepa mutante ΔpnpA formó una biopelícula escasa con muchas áreas vacías entre las células bacterianas individuales. En la cepa complementada con PNPasa, las biopelículas se parecían a las formadas por la cepa de tipo salvaje. Además, se cuantificaron las diferencias estructurales en la formación de biopelículas (Fig. 3c). El biofilm de tipo salvaje presentó más biomasa y fue significativamente más grueso que el biofilm mutante ΔpnpA. En cuanto a la rugosidad del biofilm, los biofilms de tipo salvaje presentaron un coeficiente de rugosidad más bajo que el biofilm mutante ΔpnpA, ya que el tipo salvaje tiene un aspecto más homogéneo, mientras que el mutante ΔpnpA tiene un biovolumen reducido y presenta más espacios huecos. Las biopelículas de la cepa complementada con PNPasa mostraron valores intermedios de biomasa y rugosidad, aunque el grosor máximo fue mayor que el de tipo salvaje debido a la heterogeneidad en la adquisición de imágenes de la pila z. Juntos, estos resultados validan la información obtenida de los ensayos CV y ​​juntos apuntan hacia una disminución en la formación de biopelículas mutantes ΔpnpA.

Para comprender mejor la naturaleza morfológica de la formación reducida de biopelículas de Listeria cuando no se expresa PNPasa, la arquitectura de biopelículas del mutante ΔpnpA de tipo salvaje y la cepa complementada con PNPasa se estudió más a fondo mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Se observó fácilmente que las biopelículas de la cepa de tipo salvaje exhibían una superficie suave e hidratada que era bastante diferente de la superficie rugosa y agrietada que se encuentra en el mutante ΔpnpA (Fig. 3d). Un mayor aumento reveló que las bacterias de tipo salvaje estaban cubiertas en su mayoría por el material extracelular, lo que dificultaba la observación de los contornos de las células individuales. En marcado contraste, las bacterias mutantes ΔpnpA no estaban incrustadas en una matriz extracelular densa y las células se detectaron fácilmente. La cepa complementada con PNPasa mostró un fenotipo de biopelícula más similar al tipo salvaje con una superficie lisa y mayor contenido de matriz extracelular que el mutante ΔpnpA. Sin embargo, observamos que la complementación no fue total ya que también se detectaron algunos parches de superficie rugosa de biopelícula y bacterias no atrapadas en la matriz extracelular. La complementación parcial de diferentes fenotipos obtenidos en la cepa ΔpnpA::pnpA probablemente esté relacionada con diferentes niveles de expresión de PNPasa en las diferentes condiciones de ensayo aquí probadas. Esto podría ser una consecuencia de la estrategia de clonación utilizada para la amplificación del gen pnpA para la clonación en el plásmido pPL2, que podría haber pasado por alto regiones activadoras u otros promotores ubicados en la secuencia aguas arriba de pnpA (ver "Métodos").

En general, este conjunto de resultados mostró que la PNPasa afecta las biopelículas de L. monocytogenes al alterar la formación de la matriz extracelular. La inactivación de Listeria PNPase conduce a biopelículas reducidas y más delgadas con un contenido significativamente menor de su matriz extracelular.

La matriz de las biopelículas de Listeria monocytogenes está compuesta por EPS, es decir, eDNA, proteínas y polisacáridos46. Siguiendo el conjunto anterior de resultados, investigamos la composición de la matriz de biopelícula macromolecular de las cepas de tipo salvaje, ΔpnpA y complementadas para comprender si las diferencias observadas en la estructura y morfología de la biopelícula se debieron a cambios en la composición de la matriz. Las biopelículas cultivadas durante 48 h a 37 °C se eliminaron de la superficie abiótica y se sometieron a sonicación para separar el EPS de las células bacterianas. Después de la sonicación, se midió la DO600 para una mayor normalización de cada componente de la matriz frente a la biomasa de biopelícula total de cada cepa. El EPS recuperado en el sobrenadante se cuantificó aún más utilizando distintas técnicas bioquímicas según el componente del estudio: método de extracción con fenol-cloroformo para eDNA, método de Bradford para proteínas y método de fenol-ácido sulfúrico para polisacáridos. Sorprendentemente, los resultados indican que la cantidad de los tres componentes principales de la matriz extracelular de Listeria se redujo en la cepa mutante ΔpnpA en comparación con el tipo salvaje (Fig. 4a). Además, observamos que la cepa complementada fue capaz de recuperar parcialmente el fenotipo de tipo salvaje.

a Cuantificación relativa del contenido extracelular de ADN, proteínas y polisacáridos en la matriz de biopelículas cultivadas durante 48 h a 37 °C. Los valores de réplica promediados se transformaron como el porcentaje relativo al tipo salvaje. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes. La significancia se determinó mediante una prueba t no pareada; *P < 0,05, **P < 0,01. b Imágenes representativas del análisis CLSM de la composición de la matriz del biofilm. Se usó SYTO™ 9 como control para teñir bacterias, se usó yoduro TO-PRO™-3 para tinción de ADN extracelular, SYPRO® Ruby para tinción de proteínas y RR-OP para tinción de polisacáridos.

Para validar aún más estos resultados y visualizar los diferentes componentes de la matriz, el CLSM analizó las biopelículas cultivadas durante 48 horas después de teñirlas con tintes específicos para cada componente, como se muestra en las imágenes representativas de la Fig. 4b. El colorante fluorescente de yoduro TO-PRO™-3 se dirige a los ácidos nucleicos, pero no a las bacterias con membranas intactas. Por lo tanto, se ha utilizado para la detección de eDNA en la matriz extracelular, ya que permite distinguir entre eDNA y el ADN que se encuentra dentro de las células del biofilm, cuando se usa simultáneamente con el colorante SYTO™ 945. En la Fig. 4b, se detectó una fuerte reducción de los niveles de eDNA en la biopelícula mutante ΔpnpA con solo unas pocas células teñidas, mientras que se observó un patrón estelar de eDNA en la biopelícula de tipo salvaje. El tinte FilmTracer™ SYPRO® Ruby Biofilm Matrix se usa para la detección de proteínas47 y pudo unirse a agregados ricos en proteínas en la matriz de la biopelícula de tipo salvaje, pero solo tiñó células individuales en la biopelícula mutante ΔpnpA (Fig. 4b). Esto demuestra que existe un menor contenido de proteínas en la matriz extracelular de la cepa deficiente en PNPasa. La tinción de polisacáridos presentes en la matriz de biopelícula de Listeria fue un procedimiento más desafiante. Primero, probamos el colorante fluorescente aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugado con Alexa Fluor 633, comúnmente utilizado para detectar polisacáridos en biopelículas Gram-positivas, concretamente en Staphylococcus aureus48. Sin embargo, este tinte no fue efectivo en el marcaje de polisacáridos en biopelículas de Listeria, al menos en las condiciones aquí probadas. Para superar esta dificultad, a continuación probamos el rojo de rutenio (RR), un colorante que se une a los carbohidratos y que se sabe que tiñe las biopelículas de Listeria49. RR no es fluorescente, pero cuando se conjuga con 1,10-fenantrolina (OP) no fluorescente da como resultado el complejo RR-OP fluorescente, utilizado anteriormente para marcar sustratos aniónicos como la cromatina de los núcleos de los eritrocitos50. Sintetizamos RR-OP y probamos su capacidad para marcar los polisacáridos presentes en Listeria EPS. Como se observa en la Fig. 4b, RR-OP se une con éxito a los polisacáridos presentes en la matriz del biofilm. La tinción fue más intensa en la matriz de tipo salvaje pero tiñó mal el mutante ΔpnpA, lo que demuestra que hay niveles más bajos de polisacáridos en la matriz de biopelícula mutante. Hasta donde sabemos, esta fue la primera vez que se usó RR-OP como método de tinción fluorescente para polisacáridos en biopelículas de Listeria, lo que proporcionó una nueva herramienta que podría ser útil para el estudio de biopelículas bacterianas. En conjunto, estos resultados muestran que la inactivación de la PNPasa conduce a la reducción del EPS en las biopelículas de Listeria, lo que afecta los niveles de eDNA, proteínas y polisacáridos.

Los biofilms son más resistentes a la acción de los agentes antimicrobianos debido a su estructura robusta y al papel protector de la matriz circundante. Dado que la inactivación de PNPasa conduce a biopelículas más delgadas con menos contenido de EPS, a continuación evaluamos si las biopelículas deficientes en PNPasa eran menos resistentes al tratamiento con antibióticos. Se seleccionaron los dos antibióticos utilizados para el tratamiento de la listeriosis, en este caso la gentamicina y la eritromicina (considerados agentes terapéuticos de primera y segunda línea, respectivamente51,52). En primer lugar, se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de cultivos planctónicos cultivados en caldo BHI y no se encontraron diferencias entre las cepas, en términos de cultivabilidad bacteriana en placas BHI-A (3 µg/mL para gentamicina y 0,1 µg/mL para eritromicina). ). Luego, las biopelículas mutantes ΔpnpA y de tipo salvaje cultivadas estáticamente en BHI durante 48 h se sometieron a un tratamiento con dosis altas de cada antibiótico. Después de 24 h, las biopelículas se lavaron, se sometieron a un baño de ultrasonidos y se rasparon para liberar las células adheridas a la superficie abiótica. Las células de biopelícula recuperadas se sembraron en placas de agar BHI para la evaluación de CFU/mL. Paralelamente, se usó BHI sin antibiótico como control para la cultivabilidad celular. No hubo diferencias significativas entre el tipo salvaje y el mutante ΔpnpA cuando no se agregó antibiótico a las biopelículas preformadas, lo que demuestra que la inactivación de la PNPasa no afecta la capacidad de cultivo celular en las biopelículas de Listeria (Fig. 5). Por el contrario, cada tratamiento con antibióticos resultó en una capacidad de cultivo más baja para el mutante ΔpnpA en comparación con el tipo salvaje, aunque observamos que esta reducción fue inferior a 1 log. Este efecto fue más pronunciado con el tratamiento con gentamicina (la cepa ΔpnpA fue un 75% menos cultivable), aunque también se observó una reducción en la cultivabilidad cuando se usó eritromicina (la cepa ΔpnpA fue un 40% menos cultivable) (Fig. 5). La cepa complementada mostró una complementación casi completa en ambos tratamientos con antibióticos. Estos resultados muestran que la biopelícula de la PNPasa mutante es más susceptible a los antibióticos que la de tipo salvaje. Esto está totalmente de acuerdo con nuestras observaciones anteriores de que las biopelículas deficientes en PNPasa están menos estructuradas y tienen menos componentes de matriz extracelular.

Las biopelículas cultivadas durante 48 h a 37 °C se sometieron a un tratamiento de 24 h con altas dosis de gentamicina (10X MIC) o eritromicina (100X MIC). Como control de la cultivabilidad bacteriana, se añadió BHI en lugar de antibiótico. Después de cada tratamiento, las células cultivables recuperadas se cuantificaron como UFC/mL. Los valores replicados se promediaron y transformaron como el porcentaje de CFU/ml en relación con el tipo salvaje. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes. La significación se determinó mediante ANOVA de dos vías; ns, no significativo; ****P < 0,0001.

Para comprender mejor cómo la PNPasa afecta la expresión génica en la formación de biopelículas, comparamos el transcriptoma entre cultivos de biopelículas mutantes ΔpnpA y de tipo salvaje. El ARN total se extrajo de cultivos de biopelícula cultivados durante 48 h a 37 ° C y se sometió a secuenciación de ARN (RNA-seq). A partir de los datos de RNA-seq, evaluamos la expresión diferencial de la transcripción entre las biopelículas mutantes y de tipo salvaje ΔpnpA calculando y trazando el cambio de pliegue para cada transcripción en un diagrama de dispersión MA (Fig. 6a). Para determinar los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) que fueron estadísticamente significativos, definimos los siguientes parámetros: una tasa de descubrimiento falso (FDR) inferior a 0,1, un cambio de pliegue superior a 2 y un valor de expresión de las transcripciones (log2 CPM) superior de 3. Aunque la dispersión de los valores de cambio de veces log2 se redujo considerablemente para la mayoría de las transcripciones, se expresaron diferencialmente un total de 103 genes (Tabla complementaria 1), de los cuales 46 estaban regulados a la baja y 57 estaban regulados al alza (Fig. 6a) . Sorprendentemente, cuando los DEG se agruparon según su función biológica general, observamos que la mayoría de los DEG formaban parte del "transporte y metabolismo de carbohidratos" (n = 14) o del "transporte y metabolismo de aminoácidos" (n = 11 ), junto con los DEG no categorizados (n = 37) (Fig. 6b). A continuación, los DEG se asignaron a la base de datos KEGG para atribuir cada gen a su ruta respectiva, seguido de un análisis de enriquecimiento de la ruta KEGG (Fig. 6c). Los resultados mostraron un enriquecimiento en las vías involucradas en "Vías metabólicas" (n = 36), "Biosíntesis de metabolitos secundarios" (n = 22) y "Metabolismo microbiano en diversos entornos" (n = 14). Podemos observar una buena correlación entre las categorías determinadas en la Fig. 6b y las vías KEGG enriquecidas descritas en la Fig. 6c: la categoría "Transporte y metabolismo de aminoácidos" está respaldada por el enriquecimiento de "Biosíntesis de aminoácidos", "Alanina, aspartato y el metabolismo del glutamato", y las rutas de la "biosíntesis de valina, leucina e isoleucina"; de la misma manera, la categoría "Transporte y metabolismo de carbohidratos" puede englobar las vías KEGG "Metabolismo del carbono", "Ciclo del citrato" y "Glucólisis/Gluconeogénesis".

un diagrama de dispersión MA que compara la expresión de transcripciones entre dos réplicas biológicas de L. monocytogenes EGD-e de tipo salvaje y biopelículas mutantes ΔpnpA. Los genes con expresiones significativamente diferentes se resaltan en rojo si están regulados al alza o en verde si están regulados a la baja en las biopelículas ΔpnpA en comparación con el tipo salvaje. El corte de FDR es <0.10. Las dos líneas horizontales corresponden al corte de un log2 fold change de 1, y la línea vertical al corte del log2 CPM de 3. NS no significativo. b Visualización global de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) divididos en categorías biológicas generales. El número de genes que pertenecen a cada categoría está en blanco. c DEG con un enriquecimiento significativamente mayor agrupado en vías KEGG predichas. d Mapa de calor del perfil transcripcional de los DEG. Se realizó un agrupamiento jerárquico para agrupar genes con un patrón de expresión similar en términos de log2 RPKM. e Lea los gráficos de cobertura de tres genes regulados al alza (lmo0096, lmo0783, lmo0784) y tres genes regulados a la baja (lmo1984, lmo1986, lmo2006). lmo0783-0784 se muestran en el operón. La línea azul corresponde al tipo salvaje, mientras que la línea roja corresponde al mutante ΔpnpA. El eje y representa la cobertura de lecturas y se muestra el valor máximo de cada gen. El eje x representa la posición del gen.

Se trazó un mapa de calor, que muestra los valores de expresión normalizados de los DEG en las cepas mutantes de tipo salvaje y ΔpnpA (Fig. 6d). Luego, seleccionamos seis de esas transcripciones expresadas diferencialmente (3 genes regulados hacia arriba y 3 hacia abajo) como ejemplos de nuestros datos de RNA-seq y trazamos su cobertura de lectura para evaluar la profundidad de secuenciación en ambas cepas (Fig. 6e). A continuación, se seleccionaron como genes representativos los genes que presentaron mayor y menor log2 FC, y que han sido previamente asociados con la formación de biopelículas según la literatura (Cuadro 1). Por ejemplo, la inactivación de PNPasa condujo a la regulación positiva de genes del sistema de detección de quórum Agr (lmo0048, lmo0049), genes de los sistemas de transporte de manosa/glucosa (lmo0096, lmo0783, lmo0784) y maltosa (lmo2124, lmo2125), junto con genes implicado en la ruta de las pentosas fosfato (lmo0342, lmo0343, lmo0345). Las categorías que fueron fuertemente reguladas a la baja por la inactivación de PNPasa fueron "Transporte y metabolismo de aminoácidos" (lmo1733, lmo1835, lmo1984, lm01986, lmo2006) junto con "Producción y conversión de energía" (lmo1052-1055). Los resultados de RNA-seq se validaron mediante análisis de qPCR, utilizando un subconjunto de estos genes representativos (Tabla 1). Observamos una buena correlación entre las dos técnicas, lo que indica que los resultados de qPCR fueron consistentes con los datos de RNA-seq.

Nuestros resultados han demostrado que hubo una expresión alterada en categorías biológicas importantes para la formación de biopelículas en la biopelícula mutante ΔpnpA en comparación con la de tipo salvaje, y la mayoría de los DEG bajo el control de la PNPasa están integrados en procesos relacionados con carbohidratos o aminoácidos. . Estos datos corroboran nuestro conjunto anterior de resultados que muestran que la PNPasa afecta los niveles de polisacáridos y proteínas de la matriz extracelular de las biopelículas de Listeria monocytogenes.

Para evaluar aún más el papel de la PNPasa en la regulación de los DEG más importantes, realizamos ensayos de estabilidad del ARNm de rifampicina comparando el mutante ΔpnpA con cultivos de tipo salvaje. Debido a las dificultades técnicas para realizar esta técnica en biopelículas, alternativamente hemos utilizado cultivos en fase estacionaria crecidos en medio BHI a 37 °C ya que en esta etapa de crecimiento, las bacterias son fisiológicamente más similares a las bacterias sésiles presentes en biopelículas53. Los niveles de los mRNAs de los genes de interés fueron evaluados por Northern blot utilizando sondas específicas.

Observamos que la inactivación de la PNPasa resultó en la fuerte estabilización de los ARNm de los DEG regulados al alza (Tabla 1), a saber: el sistema similar a la detección de quórum lmo0048/agrB, la subunidad del transportador PTS lmo0096/manL y el transportador ABC del azúcar lmo2125/malE ( Figura 7a). Esta estabilización fue particularmente obvia cuando se analizaron los ARNm de lmo0048 y lmo0096, que mostraron niveles apenas detectados en el tipo salvaje, lo que no permitió una cuantificación confiable de las vidas medias de los ARNm en esta cepa. Observamos que se observaron dos bandas de diferentes tamaños con la sonda lmo0048: una banda más larga correspondiente al ARNm monocistrónico (detectado tanto en el mutante WT como en el ΔpnpA) y una banda más corta correspondiente a un intermedio de descomposición (solo detectado en el mutante ΔpnpA ). Los niveles de ambas especies de ARNm son más altos en el mutante ΔpnpA en comparación con la cepa de tipo salvaje, siendo particularmente evidente la fuerte acumulación del transcrito más corto en ausencia de PNPasa. Es posible que el ARNm más corto conduzca a la producción de una proteína truncada Lmo0048/AgrB, que aún puede ser parcialmente funcional y afectar potencialmente las vías relacionadas con la biopelícula. En general, este conjunto de resultados demuestra que la PNPasa actúa como un regulador postranscripcional al actuar como una enzima principal involucrada en la degradación de los ARNm de los genes regulados al alza identificados en nuestro análisis de ARN-seq. Por el contrario, se observó que el ARNm de un gen regulado a la baja seleccionado (lmo2006) decaía un poco más rápido en el mutante ΔpnpA, lo que probablemente contribuye a los niveles reducidos observados de esta transcripción en esta cepa.

a Transferencias Northern analizadas con oligos específicos para la detección de lmo0048, lmo0096, lmo2125 y lmo2006, comparando el ARN extraído de cultivos tratados con rifampicina de la cepa de tipo salvaje y mutante ΔpnpA. La estabilidad del ARN se muestra en minutos bajo la transcripción respectiva. tmRNA sirve como control de carga. Se muestra un gel representativo para cada sonda de dos réplicas independientes. Se muestra un marcador de tamaño de ARN a la izquierda del panel. Se detectaron dos bandas con la sonda lmo0048; la cuantificación de la vida media que se muestra debajo de la imagen correspondiente está relacionada con la banda más corta. La cuantificación de la banda superior mostró una estabilidad de 6,2 ± 0,6 en el tipo salvaje y de 7,0 ± 0,58 en el mutante ΔpnpA. NQ no cuantificable. b Actividad de β-galactosidasa de la fusión Plmo0048-lacZ y la fusión Plmo2006-lacZ en la cepa de tipo salvaje y mutante ΔpnpA cultivada en BHI hasta la fase estacionaria. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. La significación se determinó mediante ANOVA de dos vías; ns, no significativo; *P < 0,05. c Transferencias de Northern analizadas con oligos específicos para la detección de prfA, hly, inlA y mogR, comparando el ARN extraído de cultivos tratados con rifampicina de la cepa de tipo salvaje y mutante ΔpnpA. La estabilidad del ARN se muestra en minutos debajo de la imagen correspondiente. tmRNA sirve como control de carga. Se muestra un gel representativo para cada sonda de dos réplicas independientes. Se muestra un marcador de tamaño de ARN a la izquierda del panel. d Análisis de transferencia Western del extracto de proteína total usando anticuerpo anti-InlA. El anticuerpo anti-EF-Tu se usó como control de carga. Cuantificación relativa de RQ.

Además, construimos y analizamos fusiones transcripcionales para probar si la PNPasa podría afectar la transcripción de lmo0048/agrB (un gen regulado al alza) y/o lmo2006/alsS (un gen regulado a la baja) (Fig. 7b). La actividad promotora de estos genes se analizó utilizando el plásmido pTCV y lacZ como gen informador54. Los ensayos de β-galactosidasa mostraron que no hubo diferencias significativas entre el tipo salvaje y el mutante ΔpnpA, lo que sugiere que la PNPasa no afecta significativamente la transcripción de estos genes. Teniendo en cuenta que no observamos cambios significativos en la transcripción de lmo0048 (Fig. 7b), esto confirma que los niveles más altos de los dos ARN en la Fig. 7a se deben a su estabilización en ausencia de PNPase; por lo tanto, la PNPasa es responsable de su degradación. La transcripción más corta de lmo0048 no fue consecuencia de una mayor transcripción; en cambio, lo más probable es que este ARNm resulte de la escisión de la transcripción más larga de lmo0048 por otras ribonucleasas, siendo eliminado rápidamente por la PNPasa, lo que explica por qué este ARNm no se detectó en el tipo salvaje (Fig. 7a).

Dado que observamos que la inactivación de PNPase da como resultado una invasión reducida de líneas celulares humanas (Fig. 1) y motilidad bacteriana (Fig. 2), ampliamos aún más nuestros estudios a genes importantes para estos fenotipos, aunque no parecen ser diferencialmente expresado en nuestros datos transcriptómicos de biopelículas. Usando ensayos de estabilidad de ARNm de rifampicina y análisis de transferencia Northern, se encontró que la inactivación de PNPasa resultó en niveles más bajos de ARNm del activador transcripcional de genes de virulencia, prfA, junto con dos genes regulados por prfA, a saber, inlA (codifica para Internalina A) y hly (codifica para Listeriolisina O) en cultivos en fase estacionaria (Fig. 7c). Esta regulación parece estar provocada indirectamente, ya que la estabilidad de estos transcritos no se vio muy afectada por la ausencia de PNPasa. También observamos niveles reducidos de proteína de Internalina A en extractos celulares del mutante ΔpnpA, lo que muestra que los niveles reducidos de ARNm de inlA se correlacionan con niveles más bajos de proteína (Fig. 7d). Por otro lado, observamos que la PNPasa no afecta los niveles y la estabilidad del ARNm de mogR, el represor transcripcional de los genes de motilidad (Fig. 7c).

En general, estos resultados muestran que la PNPasa regula los niveles de expresión de los genes implicados en la biopelícula y la virulencia y respalda que la PNPasa es una enzima importante implicada en la regulación postranscripcional de la formación de biopelículas.

En este trabajo, presentamos la ribonucleasa PNPasa como un nuevo regulador de la formación de biopelículas y la virulencia en el patógeno Gram-positivo Listeria monocytogenes. Demostramos que la PNPasa es un determinante positivo de la producción de biopelículas en la cepa EGD-e de L. monocytogenes, lo que afecta la biomasa, la morfología y la estructura de la biopelícula. La cepa con deleción de PNPase produjo menos biomasa de biopelícula, exhibiendo una biopelícula más delgada, más rugosa y con una superficie de aspecto seco, y menos estructurada que la de tipo salvaje. Esto se correlacionó con defectos importantes en la composición de la matriz extracelular del biofilm del mutante ΔpnpA, que exhibió un contenido menor de proteínas, polisacáridos y ADN extracelular, según lo detectado por ensayos bioquímicos y microscopía. De hecho, no se encuentra que las bacterias presentes en las biopelículas ΔpnpA estén incrustadas significativamente en una capa de matriz, en marcado contraste con lo que se observa en las biopelículas de tipo salvaje donde las bacterias están rodeadas por una matriz gruesa. Estos defectos estructurales hacen que la producción de biopelículas sea débil en el mutante ΔpnpA, lo que muy probablemente provoca el aumento de la susceptibilidad de las biopelículas de Listeria a los antibióticos. Además, la inactivación de Listeria PNPase resultó en cambios fenotípicos en macrocolonias y motilidad celular reducida, dos características ampliamente asociadas con la formación de biopelículas.

La PNPasa se ha asociado previamente con la formación de biopelículas en bacterias Gram-negativas; sin embargo, su función exacta es controvertida. Mientras que se demostró que la PNPasa es un regulador positivo de la formación de biopelículas en E. coli K-1238 y en Salmonella Typhimurium36,37, otro estudio que utilizó E. coli C propuso a la PNPasa como un inhibidor de la formación de biopelículas39. El efecto de la PNPasa en la producción de biopelículas parece depender de la especie, al menos en bacterias Gram-negativas. Sin embargo, actualmente existe una falta de información sobre el papel de la PNPasa en el establecimiento de biopelículas en bacterias Gram-positivas y nuestro trabajo pretende llenar ese vacío. Para comprender mejor cómo la PNPasa contribuye a la formación de biopelículas de L. monocytogenes, se realizó el análisis transcriptómico de las biopelículas mutantes ΔpnpA y de tipo salvaje. Se descubrió que la PNPasa afecta los niveles de expresión de varios genes y múltiples vías reguladoras, como se esperaba de un importante regulador postranscripcional. Se obtuvo un total de 103 DEG afectados por PNPase, con 57 y 46 genes mostrando regulación positiva y negativa, respectivamente, mediante RNA-seq. La mayoría de los DEG formaban parte de los grupos "Transporte y metabolismo de carbohidratos" o "Transporte y metabolismo de aminoácidos".

Los genes implicados en la detección de quórum y los genes implicados en el transporte y el metabolismo de los carbohidratos se encuentran entre los genes más regulados al alza en las biopelículas de Listeria que no expresan PNPasa (Fig. 6 y Tabla 1). Descrito inicialmente en S. aureus, el sistema de detección de quórum Agr en L. monocytogenes está codificado en el operón lmo0048-lmo005155. Nuestros resultados revelaron la regulación al alza de los genes lmo0048 (que codifica un homólogo del sensor histidina quinasa AgrB de S. aureus) y lmo0049 (que codifica un homólogo del péptido autoinductor AgrD de S. aureus) en biopelículas del mutante ΔpnpA (Fig. 6 y Tabla 1). ). Anteriormente se demostró que el operón Agr es importante para la formación de biopelículas de Listeria ya que los mutantes de Agr, a saber, Δlmo0049 (ΔagrD), se vieron afectados en la adhesión y en las primeras 24 h de formación de biopelículas20,21,56. La expresión del operón agr de L. monocytogenes está sujeta a regulación temporal, con niveles crecientes de expresión que se encuentran en las primeras etapas del crecimiento del biofilm y una disminución posterior a medida que el biofilm madura13. Observamos que esta regulación temporal del sistema agr es defectuosa en ausencia de PNPasa; los altos niveles de transcritos de agrB y agrD observados en biopelículas después de 48 h de crecimiento podrían ayudar a explicar la reducción en la biomasa de biopelícula encontrada en el mutante ΔpnpA.

Además, se encontró que varios genes involucrados en el transporte de azúcar y la bioenergética estaban regulados al alza en las biopelículas mutantes ΔpnpA. Estos incluyen genes del sistema azúcar:fosfotransferasa (PTS) dependiente de fosfoenolpiruvato (PEP) para la captación de alta afinidad de manosa y glucosa. El PTS comprende dos proteínas fosfotransferasa generales (EI y HPr) y un número variable de complejos de enzima II específicos de azúcar; EI y HPr transfieren grupos fosforilo de PEP a EIIAB que es responsable de la fosforilación de diferentes azúcares, con EIICD actuando como transportadores57,58. Nuestros resultados indican la regulación al alza de lmo0096 (EIIABMan/Glu) del operón Man y de lmo0783 (EIIAMan/Glu) y lmo0784 (EIIBMan/Glu) del operón Mpo. La sobrerregulación de estas PTS puede representar un aumento en el consumo de PEP glucolítica, reduciendo así su disponibilidad para la biosíntesis de aminoácidos aromáticos y precursores de la pared celular59. Lo más probable es que esto contribuya a la menor producción de matriz de biopelícula observada en las biopelículas de Listeria ΔpnpA. De acuerdo con esta hipótesis, las enzimas PTS están reguladas a la baja durante la formación de biopelículas en otras bacterias Gram-positivas, como se observa en Streptococcus pneumoniae60 y en formadores de biopelículas fuertes y débiles de Enterococcus faecalis61. Otros genes regulados positivamente incluyen lmo2124 y lmo2125 que codifican el transportador de cassette de unión a ATP responsable de la captación de maltosa/maltodextrina, que luego se utiliza en la glucólisis en forma de glucosa62. También observamos la regulación al alza de siete genes del operón gol (lmo0341-0351), que codifican enzimas implicadas en la fase no oxidativa de la vía de las pentosas fosfato (lmo0342, lmo0343 y lmo0345), en el metabolismo del glicerol (lmo0344, lmo0347 , y lmo0348) y en la glucólisis (lmo0346)63,64. En conjunto, la mayor expresión de estos genes sugiere que el metabolismo de los carbohidratos se centra preferentemente en la producción de energía más que en las vías biosintéticas. Esto podría ayudar aún más a explicar la baja biosíntesis de los componentes de la matriz y la consiguiente formación defectuosa de biopelículas observada en ausencia de PNPasa.

Entre los genes regulados a la baja que se encuentran en las biopelículas defectuosas con PNPasa, fue igualmente posible identificar las vías metabólicas que afectan la formación de biopelículas (Fig. 6 y Tabla 1). Una categoría importante era el metabolismo de los aminoácidos e incluía los genes lmo1984 (ilvB), lmo1986 (ilvC), lmo2006 (alsS), que están involucrados en la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada como la isoleucina, la leucina y la valina. Se ha demostrado que estos aminoácidos promueven la formación sólida de biopelículas en diferentes bacterias: por ejemplo, se encontraron altos niveles de leucina y valina en biopelículas de E. coli65,66; se encuentran entre los aminoácidos promotores de biopelículas identificados en Pseudomonas aeruginosa67; y el metabolismo de la isoleucina, la leucina y la valina es esencial durante la formación del biofilm de Bifidobacterium bifidum68. Otro gen regulado a la baja que participa en el metabolismo de los aminoácidos es lmo1733 (gltD), que codifica la subunidad más pequeña de la glutamato sintasa y es responsable de la conversión de glutamina en glutamato. También se descubrió que este aminoácido afecta la formación de biopelículas, con defectos en esta vía metabólica que conducen a una menor adhesión a las superficies sólidas y, en consecuencia, a una menor formación de biopelículas en L. monocytogenes69 y Bacillus subtilis70. En general, la expresión reducida de estos genes de aminoácidos concuerda con el menor contenido de proteínas de la matriz extracelular y el biofilm menos estructurado observado en el mutante ΔpnpA. Además, otro conjunto de genes regulados negativamente consiste en el operón lmo1052-1055 que codifica el complejo piruvato deshidrogenasa (operón pdh), responsable de la conversión de piruvato en acetil-CoA. En Streptococcus suis, la expresión proteica de PDH fue mayor en el estado de biopelícula que en planctónico71 y la formación de biopelícula disminuyó significativamente después de la eliminación de PDH72.

Los ensayos de estabilidad del ARNm de rifampicina y el análisis de transferencia Northern revelaron que la PNPasa está involucrada en la degradación de al menos un subconjunto representativo de los genes regulados positivamente identificados en el análisis transcriptómico de biopelículas. En la cepa mutante ΔpnpA, se observó una fuerte estabilización en las transcripciones de lmo0048/agrB, lmo0096/manL y lmo2125/malE en comparación con la cepa de tipo salvaje. Los altos niveles de estas transcripciones no parecen ser consecuencia del aumento de la transcripción en ausencia de PNPasa, ya que una fusión transcripcional del promotor de lmo0048 con lacZ no mostró diferencias significativas en la actividad de β-galactosidasa entre la cepa de tipo salvaje y la mutante ΔpnpA. Estos resultados confirman que la PNPasa es un importante regulador postranscripcional de genes implicados en la formación de biopelículas, lo que respalda que los DEG regulados al alza son una consecuencia de la mayor estabilidad de estas transcripciones en ausencia de PNPasa. Los niveles más altos de estos ARNm pueden potenciar la traducción de las proteínas correspondientes y, por lo tanto, afectar las vías de formación de biopelículas.

Por otro lado, se observó que el mRNA de lmo2006/alsS decaía ligeramente más rápido en el mutante ΔpnpA. Esto sugiere que la PNPasa puede actuar indirectamente para controlar la estabilidad de los ARNm de los DEG regulados a la baja. Por ejemplo, la PNPasa podría estar controlando los niveles de un represor de estos transcritos (como los ARNs)73,74, o la PNPasa podría estar protegiendo estos ARNm de la degradación por otras ribonucleasas, de manera similar a lo que se describió para la ARNasa II en E. coli75.

Además, se encontró que la PNPasa afecta la expresión de genes importantes para la virulencia de Listeria. Sorprendentemente, el mutante ΔpnpA mostró niveles reducidos de ARNm del activador transcripcional de genes de virulencia, prfA, lo que podría implicar niveles más bajos de proteína PrfA. Dado que PrfA está autorregulado, parece probable que niveles más bajos de PrfA puedan conducir a una reducción en la expresión de factores de virulencia76. De hecho, observamos que los factores de virulencia inlA/Internalina A y hly/Listeriolisina O presentaron valores reducidos de ARNm en el mutante ΔpnpA sin mayores diferencias en las vidas medias del ARNm entre el mutante ΔpnpA y la cepa de tipo salvaje. Es importante destacar que encontramos niveles reducidos de Internalina A en ausencia de PNPasa (Fig. 7). De hecho, la menor expresión de estos factores de virulencia podría ayudar a explicar la invasión reducida de líneas celulares humanas por parte del mutante ΔpnpA. Además, la disminución de la expresión de PrfA probablemente contribuya a los niveles reducidos de biopelículas observados en los mutantes ΔpnpA. Informes anteriores destacaron que PrfA y los miembros del regulón PrfA actúan como determinantes positivos de la producción de biopelículas en Listeria monocytogenes, dado que los mutantes eran defectuosos en la formación de biopelículas adheridas a la superficie23,77,78. Se propuso23 que estos defectos pueden resultar de alteraciones en la superficie celular que son perjudiciales para el desarrollo de biopelículas, ya que PrfA regula la expresión de factores de superficie celular (como Internalina A) y proteínas secretadas (como Listeriolisina O), cuyos niveles de ARNm también se redujeron en el mutante ΔpnpA. Finalmente, también probamos si la PNPasa estaba involucrada en la regulación de MogR, el represor transcripcional de los genes de motilidad flagelar. Sin embargo, no se encontró que la PNPasa afectara los niveles de ARNm de mogR, lo que significa que el defecto en la motilidad observado en la cepa mutante ΔpnpA parece ser independiente de MogR. Por lo tanto, la regulación de la motilidad bacteriana dependiente de PNPasa es más compleja de lo previsto.

L. monocytogenes es uno de los principales patógenos transmitidos por los alimentos y el agente causante de la listeriosis, una infección bacteriana con una alta tasa de mortalidad en pacientes inmunocomprometidos9. La contaminación de los productos alimenticios debido a la presencia de biopelículas en los entornos de procesamiento de alimentos provoca una carga económica en todo el mundo79. Identificamos la proteína de unión a ARN y la ribonucleasa PNPasa como un regulador importante de la patogenicidad de L. monocytogenes, que afecta no solo la invasión de las células del huésped sino también la formación de biopelículas. Además, descubrimos vías reguladoras dependientes de PNPasa importantes para el desarrollo de biopelículas de Listeria, lo que destaca la importancia de la regulación postranscripcional para la adaptación al estilo de vida de la biopelícula de las bacterias patógenas. Se ha demostrado que otras proteínas de unión a ARN, como Hfq y CsrA, están implicadas en el control de la formación de biopelículas, concretamente a través de su efecto sobre la motilidad, la producción de polisacáridos extracelulares, la producción de c-di-GMP, entre otros29,80,81, 82.

En conclusión, hemos demostrado por primera vez que la PNPasa es un regulador postranscripcional de la formación de biopelículas de Listeria monocytogenes, y la inactivación de la PNPasa reduce la producción de biopelículas. Nuestros resultados muestran que la PNPasa afecta múltiples vías metabólicas, desde el metabolismo de los carbohidratos hasta los aminoácidos y el sistema de detección de quórum, lo que afecta la producción de matriz extracelular y, en consecuencia, la formación de biopelículas de Listeria en superficies abióticas. Este trabajo destaca la importancia de las proteínas de unión a ARN en la adaptación a un estilo de vida sésil y amplía nuestro conocimiento sobre la formación de biopelículas en bacterias patógenas Gram-positivas.

Todas las cepas bacterianas y los plásmidos se enumeran en la Tabla complementaria 2. Las cepas utilizadas en este estudio son la cepa EGD-e de Listeria monocytogenes (tipo salvaje) y su mutante isogénico ΔpnpA (que lleva un mutante nulo de PNPase/Lmo1331). La complementación de PNPasa se obtuvo mediante la clonación de un fragmento de PCR que contiene la secuencia total de pnpA ORF con 343 bps aguas arriba y 162 bps aguas abajo (cebadores pPL2-pnpA-BamHI y pPL2-pnpA-SalI) en el vector pPL2 después de la integración en el mutante ΔpnpA cepa, lo que resulta en la cepa complementada ΔpnpA::pnpA35. Las cepas se cultivaron rutinariamente en medio Brain Heart Infusion (BHI) (BD Difco™). Para el crecimiento de ΔpnpA::pnpA, se añadió cloranfenicol hasta una concentración final de 10 μg/mL. La kanamicina se incluyó a 50 μg/mL cuando las cepas de E. coli o L. monocytogenes portaban derivados de pTCV.

Se utilizaron dos líneas celulares humanas: HeLa (ATCC® CCL-2™) y HepG2 (ATCC® HB-8065™). Las células se cultivaron rutinariamente hasta una confluencia del 80-90 % en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Biowest) con alto contenido de glucosa y l-glutamina, complementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS) (Biowest). Se sembraron HeLa (1 × 105 células/pocillo) y HepG2 (1 × 105 células/pocillo) en placas de cultivo de 24 pocillos y se incubaron a 37 °C, en una atmósfera con 5 % de CO2 durante 24 h antes de la infección (48 h para HepG2 ). El protocolo de ensayo de internalización se adaptó de la ref. 40. Brevemente, las suspensiones bacterianas se diluyeron a la multiplicidad de infección (MOI) indicada, se agregaron a las células y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Posteriormente, se añadió DMEM con gentamicina (40 μg/mL) y se incubó durante 1 h a 37 °C. Después del lavado, las células humanas se lisaron con Triton X-100 al 0,1 % (v/v) y se realizaron diluciones en serie para determinar el número de bacterias intracelulares recuperadas, expresadas como unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml).

Las imágenes se adquirieron en un microscopio vertical Leica DM 6000B equipado con una cámara Andor iXon 885 EMCCD y se controlaron con el software MetaMorph V5.8 (Molecular Devices LLC), usando el objetivo de inmersión en aceite 100×1.4 NA más un optivar de 1.6×, y el Óptica de contraste de fase. El procesamiento de imágenes se realizó utilizando el software Fiji. Las imágenes sin recortar se proporcionan en la figura complementaria 1.

Las imágenes de las macrocolonias se adquirieron en un microscopio estereoscópico Zeiss Axio Zoom.V16 equipado con una cámara mono CCD Zeiss Axiocam 503 y se controlaron con el software Zeiss Zen 2.1 (edición azul) (Zeiss), utilizando el objetivo 1 × 0,25 NA y el Bright Óptica de campo. El procesamiento de imágenes se realizó utilizando el software Fiji. Para la determinación de la motilidad de natación, se inoculó una suspensión bacteriana a OD600 ~ 0,7 en placas de agar blando BHI (agar al 0,3% (p/v)). Las placas se incubaron hacia arriba a 25 ° C durante 48 h y se fotografiaron con la función Epi-white en Gel Doc XR (Bio-Rad) (Fig. 2 complementaria).

Los cultivos que crecieron durante la noche se lavaron una vez en BHI fresco, se diluyeron 1:100 y se añadieron 500 µl a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Las placas se incubaron durante 48 h a 37 °C, en condiciones estáticas. Después de la incubación, las biopelículas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x sin Ca2+/Mg2+ (DPBS) (Biowest) y se secaron a 37 °C, seguido de la adición de solución de cristal violeta al 0,1 % (p/v). La placa se lavó y después de estar completamente seca, se escaneó utilizando Image Scanner III (GE). Para cuantificar la biomasa de cada biopelícula, se añadió ácido acético al 33% (v/v) para solubilizar el CV y ​​se midió A595 utilizando un espectrofotómetro (BioPhotometer plus, Eppendorf).

Se colocaron cubreobjetos redondos estériles en cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se prepararon las suspensiones bacterianas como se describe en "Ensayo de formación de biopelículas". Después de una incubación de 48 h a 37 °C, las biopelículas se lavaron con DPBS. Luego, se fijaron con la solución de fijación (glutaraldehído al 2,5% (v/v), formaldehído al 1% y tampón cacodilato 0,1 M, pH 7,4) y se lavaron con tampón cacodilato 0,1 M. Las muestras se deshidrataron progresivamente utilizando concentraciones crecientes de etanol (50%, 70%, 90%, 100%), y finalmente se añadió alcohol terc-butílico durante 2 h, seguido de congelación a -20 °C hasta su posterior uso. Las muestras se liofilizaron en condiciones de vacío y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta que se realizaron los análisis SEM. Las muestras se recubrieron con oro (∼6 nm de espesor) utilizando un pulverizador electrónico (Cressington 108) durante 15 s a 10 mA y se tomaron imágenes en un microscopio electrónico de barrido Hitachi SU8010, a 1,5 kV para una WD de 6 mm.

Se formaron biopelículas durante 48 h en cubreobjetos redondos de vidrio estériles y luego se lavaron con DPBS. Para observar el grosor de la biopelícula, las biopelículas se tiñeron con 3 µM de colorante fluorescente SYTO™ 9 (Thermo Fisher Scientific) y el CLSM adquirió imágenes usando la línea láser Ar+ de 488 nm (emisión recolectada a 500–590 nm) y escaneando pilas z con un tamaño de paso de exploración de 1,5 µm. Para observar el ADN extracelular de la matriz del biofilm y las células bacterianas, primero se añadió SYTO™ 9 (Thermo Fisher Scientific) a 3 µM en DPBS, seguido de colorante fluorescente de yoduro TO-PRO™-3 (Thermo Fisher Scientific) a 4 µM en DPBS45. Las imágenes se adquirieron usando la línea láser Ar+ de 488 nm (emisión recolectada a 500–590 nm) y la línea láser He–Ne de 633 nm (emisión recolectada a 645–795 nm), respectivamente. Se utilizó la tinción FilmTracer™ SYPRO® Ruby Biofilm Matrix (Thermo Fisher Scientific) para la tinción de proteínas47. Las imágenes se adquirieron utilizando la línea láser Ar+ de 476 nm (emisión recopilada a 600–740 nm). Se usó el complejo rojo de rutenio-fenantrolina (RR-OP) para teñir los polisacáridos en la estructura del biofilm. La síntesis del complejo RR-OP siguió un protocolo modificado por Bertolesi et al.50. Brevemente, se disolvieron 20 mg de rojo de rutenio (RR) en 10 ml de agua destilada y luego se agregaron a la solución 10 mg de 1,10-fenantrolina (OP). A continuación, la mezcla se calentó a 100 °C durante 50 min. El complejo se obtuvo como una solución de color verde oscuro, que luego se usó para teñir biopelículas a 2 mg/mL. Las imágenes se adquirieron utilizando la línea láser Ar+ de 458 nm (emisión recopilada a 490-625 nm). En todos los casos se utilizó un microscopio invertido Leica TCS SP5 con objetivo apocromático 63× agua (apertura numérica 1,2). Las imágenes se recolectaron con 512 × 512 píxeles a una velocidad de escaneo de 100 Hz, excepto las mediciones de la pila z que se realizaron a 200 Hz. Se construyeron imágenes tridimensionales de las biopelículas utilizando el software Imaris (Bitplane). La biomasa del biofilm, el espesor máximo y el coeficiente de rugosidad se cuantificaron a partir de las pilas z utilizando el software COMSTAT83.

Se siguió una adaptación del método de cuantificación descrito previamente por Combrouse et al.84 para la extracción y cuantificación de los componentes de la matriz del biofilm. Después de recolectar las biopelículas, cada suspensión se sonicó en hielo usando un sonicador de sonda (UP 200 s, Dr. Hielscher GmbH). Después de la sonicación, se midió la DO600 para una mayor normalización y las suspensiones se centrifugaron a 3100 × g para recolectar los sobrenadantes para su cuantificación. La concentración de polisacáridos en la matriz del biofilm se determinó por el método del fenol-ácido sulfúrico, utilizando glucosa como estándar85,86. Las concentraciones de proteína se cuantificaron utilizando el reactivo de Bradford87 (Bio-Rad), con albúmina de suero bovino como estándar. El ADN extracelular de la matriz del biofilm se obtuvo mediante el método de extracción con fenol-cloroformo88 y la concentración se determinó mediante NanoDropOnec (Thermo Fisher Scientific).

Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de gentamicina y eritromicina en cepas mutantes ΔpnpA y de tipo salvaje se determinaron utilizando una adaptación del método de microdilución en caldo doble en placas de microtitulación con BHI a 37 °C. La MIC se determinó por la concentración más baja de crecimiento bacteriano inhibidor de antibióticos. Para los ensayos de erradicación, después del lavado, las soluciones de antibiótico (en BHI) se agregaron a biopelículas de 48 h de edad y se incubaron durante 24 h a 37 °C. Luego, cada pocillo se lavó con DPBS estéril, seguido de sonicación en un baño de ultrasonidos durante 5 min. Se eliminó y recuperó la biopelícula y se realizaron diluciones en serie en DPBS estéril y se sembraron en placas de agar BHI. Se evaluó UFC/mL después de una incubación durante la noche a 37 °C.

Las biopelículas se lavaron con DPBS, seguido de la adición de tampón A (glucosa al 10 % (v/v), Tris 12,5 mM pH 7,5, EDTA 10 mM en H2O) a cada pocillo y se recogió la biopelícula. La lisis celular se realizó en FastPrep®-24 (MP Bio) seguido del método de fenol-cloroformo y precipitación con etanol35. Se usó Turbo DNase (Thermo Fisher Scientific) para eliminar el ADN genómico. La calidad y la integridad del ARN se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y en el fluorómetro Qubit™ 4 (Thermo Fisher Scientific).

Las muestras de ARN total de dos réplicas biológicas de cepas mutantes ΔpnpA y de tipo salvaje se secuenciaron en STAB VIDA (Portugal) con una plataforma Illumina HiSeq 4000 (extremo emparejado, longitud de lectura de 150 pb, lecturas de 20 M). La construcción de la biblioteca de cDNA se llevó a cabo utilizando el kit de preparación Kapa RNA Hyper Prep Library con eliminación de rRNA QIA FastSelect -5S/16 S/23 S. Los datos de RNA-seq se analizaron siguiendo el flujo de trabajo descrito en Pobre y Arraiano89. Las lecturas se mapearon contra el genoma de L. monocytogenes (NC_003210.1 descargado de la base de datos del genoma NCBI) utilizando el programa Bowtie2. La visualización de los datos se realizó con Artemis Genome Browser. El análisis de expresión diferencial se realizó con el paquete de R edgeR. Consideramos significativas todas las transcripciones con una corrección de tasa de descubrimiento falso (FDR) del valor P inferior a 0,1 y filtramos aún más nuestros resultados utilizando los valores de expresión (log2 CPM) superiores a 3 y un cambio de pliegue entre dos muestras superior a 2. Debido al pequeño número de réplicas biológicas para cada cepa, optamos por el uso de una corrección FDR moderada del valor de P inferior a 0,1 en lugar de un valor más estricto de 0,05 para evitar la subestimación de DEG. La anotación funcional se realizó con la herramienta de anotación funcional DAVID.

El ADNc se sintetizó a partir de 1 µg de ARN purificado utilizando el kit de síntesis de ADNc SensiFAST™ (Bioline). La transcripción inversa acoplada a una PCR cuantitativa (qPCR) se realizó con un sistema Real Time Thermal Cycler qTower (Analytik Jena) y usando el kit SensiFAST SYBR No-ROX (Bioline) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los cebadores para qPCR se enumeran en la Tabla complementaria 3. La cuantificación relativa de la expresión génica se calculó con el método 2-ΔΔCt y utilizando gyrA (lmo0007) como gen de referencia de mantenimiento.

Para determinar la estabilidad del ARN, los cultivos bacterianos se cultivaron hasta la fase estacionaria (OD600 ~ 3) en medio BHI a 37 °C, con agitación. La transcripción se bloqueó añadiendo rifampicina a una concentración final de 500 µg/mL. El punto de tiempo cero se recogió justo antes de la adición de rifampicina. Las muestras de cultivo se recogieron en puntos de tiempo definidos y se mezclaron con 0,2 volúmenes de tampón de parada de ARN (solución ácida de fenol:etanol 1:20), seguido de centrifugación y congelación instantánea. Después de resuspender los sedimentos en el tampón A, se realizó la lisis celular en FastPrep®-24 (MP Bio), seguida de extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. Para el análisis de transferencia Northern, se fraccionaron 10–40 µg de ARN total en gel desnaturalizante de agarosa formaldehído al 1 % en tampón MOPS. Los ARN se transfirieron a una membrana Hybond-N+ (Cytiva) y se reticularon con UV mediante irradiación UV utilizando un aparato UVC 500 (Amersham Biosciences). Las sondas de oligonucleótidos de ADN se marcaron con [γ-32P]-ATP (PerkinElmer) en el extremo 5' usando polinucleótido quinasa T4 (Thermo Fisher Scientific). Las sondas radiomarcadas se purificaron en columnas G25 Microspin (Cytiva). Las membranas se hibridaron en PerfectHyb Plus Hybridization Buffer (Sigma-Aldrich) a 42 °C, durante la noche, y se analizaron con el escáner FUJI TLA-5100 (Fujifilm). Las vidas medias de ARN se determinaron por regresión lineal utilizando el logarítmico del porcentaje de ARN restante frente al tiempo, considerando la cantidad de ARN a los 0 min como 100%. Las imágenes sin procesar de las transferencias Northern se proporcionan en las Figs. complementarias. 3 y 4. Las sondas de oligonucleótidos utilizadas en este trabajo se enumeran en la Tabla complementaria 3.

Para construir los vectores de fusión transcripcional Plmo0048-lacZ y Plmo2006-lacZ, la región promotora de cada gen se amplificó mediante PCR con los pares de cebadores apropiados (Tabla complementaria 3). El producto de PCR se digirió con EcoRI y BamHI (Thermo Fisher Scientific) y se insertó en el sitio correspondiente del vector de expresión basado en pTCV de bajo número de copias que lleva E. coli lacZ sin promotor (pTCV-lacZ)54. Las construcciones de plásmido resultantes se transformaron en E. coli S17-1, que se utilizó para la conjugación90 con L. monocytogenes EGD-e WT y el mutante isogénico ΔpnpA.

La actividad del promotor se analizó midiendo la actividad de β-galactosidasa usando el plásmido pTCV54. Las células se cultivaron hasta la fase estacionaria (OD600 ~ 3) en medio BHI a 37 °C, con agitación. Las muestras recolectadas (1 ml) se centrifugaron y los sedimentos se congelaron rápidamente. Los sedimentos se resuspendieron en 1 ml de tampón Z (Na2HPO4 60 mM, NaH2PO4 40 mM, KCl 10 mM, MgSO4 1 mM, β-mercaptoetanol 50 mM, pH 7,0) y se midió la DO600. Las células se permeabilizaron con tolueno al 0,5 % y etanol al 4,5 % durante 5 min a 30 °C en un baño de agua. Para determinar la actividad de β-galactosidasa, se agregaron a cada muestra 200 µL de tampón Z que contenía 4 mg/mL de o-nitrofenil-β-d-galactopiranósido (ONPG, Sigma-Aldrich), seguido de incubación a 30 °C en agua. baño. Las reacciones se detuvieron añadiendo 500 µl de NaCO3 1 M y se registró el tiempo. Se midió la absorbancia a 420 nm después de centrifugar durante 5 min a 21 000 × g. La actividad de β-galactosidasa (unidades Miller) se calculó como (1000 × A420)/(T × V × OD600). T, tiempo de reacción (en minutos); V, volumen de bacterias (en mL).

Para la extracción de proteínas totales, los cultivos bacterianos se cultivaron hasta la fase estacionaria (OD600 ~ 3) en medio BHI a 37 °C, con agitación, seguido de centrifugación. La lisis celular se realizó en FastPrep®-24 (MP Bio) y el extracto de proteína se recuperó del sobrenadante. La cuantificación de proteínas se realizó usando el reactivo de Bradford, como se indicó anteriormente.

Las muestras de proteína se cargaron en un Bolt™ 4–12 % Bis-Tris Plus Gel (Invitrogen™) con tampón MOPS 1X suplementado con Bolt™ Antioxidant (0,25 %) y se utilizó un sistema Mini Gel Tank (Invitrogen™). La transferencia a membranas de nitrocelulosa se realizó utilizando el módulo Mini Blot (Invitrogen™). Para la detección de proteínas, las membranas se bloquearon durante 1 h con solución de bloqueo (TBS + 0,1 % Tween-20 (TBS-T) + 5 % de leche en polvo descremada) y se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: conejo α-InlA 1:5000 (Cusabio) o conejo α-EF-Tu 1:40000 (Abcam) en TBS-T. El anticuerpo secundario cabra α-conejo IgG-HRP 1:20 000 (Sigma) se incubó durante 1 hora a 4 °C. La detección se realizó mediante quimioluminiscencia utilizando el sustrato de quimioluminiscencia mejorado Western Lightning® Plus-ECL (PerkinElmer) en el sistema de imágenes iBright™ CL1500 (Fig. 5 complementaria). Las imágenes se cuantificaron utilizando el software Fiji.

Los datos experimentales se analizaron utilizando GraphPad Prism versión 8.0.1 (GraphPad Software). Se usó la prueba t de Student para determinar la significancia estadística para la mayoría de los experimentos. Se realizó una comparación entre el tratamiento con antibióticos y el control mediante ANOVA de dos vías. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD) o como la media ± error estándar de la media (SEM). El valor AP de <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos discutidos en esta publicación han sido depositados en Gene Expression Omnibus de NCBI y son accesibles a través del número de acceso GEO Series GSE210097.

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Este trabajo fue apoyado por FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP, a través de: MOSTMICRO-ITQB Unidad de I+D (UIDB/04612/2020, UIDP/04612/2020); Laboratorio Asociado LS4FUTURE (LA/P/0087/2020); Otorgamiento PTDC/BIA-MIC/32525/2017 a JMA; Beca Doctoral a APQ (PD/BD/135487/2018); Contratos FCT según DL57/2016 a SNP (SFRH/BPD/92409/2013) y a VP (SFRH/BPD/87188/2012).

Instituto António Xavier de Tecnología Química y Biológica, Universidad Nueva de Lisboa (ITQB NOVA), Avenida da República, 2780-901, Oeiras, Portugal

Ana Patrícia Quendera, Vânia Pobre, Cecília Maria Arraiano & José Marques Andrade

Instituto de Bioingeniería y Biociencias (IBB) y Laboratorio Asociado—Instituto de Salud y Bioeconomía (i4HB), Instituto Superior Técnico, Universidad de Lisboa, Av. Rovisco País, 1049-001, Lisboa, Portugal

Sandra Nunes Pinto & Basco DB Bonifacio

Laboratorio de Imagenología, Nanomorfología y Espectroscopía de Rayos X (Linx) del Laboratorio Militar de Unidad de Defensa Biológica y Química (UMLDBQ), Instituto Universitario Militar, Centro de Investigación, Innovación y Desarrollo de la Academia Militar, Av. Dr. Alfredo Bensaúde, 1100-471, Lisboa, Portugal

wilson antunes

Departamento de Bioingeniería, Instituto Superior Técnico, Universidad de Lisboa, Av. Rovisco País, 1049-001, Lisboa, Portugal

Vasco DB Bonifacio

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JMA concibió el proyecto; APQ, SNP y JMA diseñaron el estudio; CMA y JMA co-supervisaron el trabajo de APQ; APQ, SNP, WA, VDBB y JMA realizaron experimentos; APQ, SNP, VP y JMA analizaron los datos; JMA realizó la administración del proyecto y la adquisición de fondos; APQ y JMA escribieron el artículo. Todos los autores contribuyeron a la discusión, revisión y edición de la versión final del manuscrito.

Correspondencia a José Marqués Andrade.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Quendera, AP, Pinto, SN, Pobre, V. et al. La ribonucleasa PNPasa es un regulador clave de la formación de biopelículas en Listeria monocytogenes y afecta la invasión de las células huésped. npj Biofilms Microbiomas 9, 34 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00397-1

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Recibido: 25 de octubre de 2022

Aceptado: 18 de mayo de 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00397-1

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